Основные принципы создания трансгенных растений

Одной из основ метода, позволившего осуществлять различные действия с генами, является открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты способны распознавать определенную последовательность своей ДНК и расщеплять «чужую» ДНК на мелкие фрагменты. В настоящее время выделены рестриктазы, распознающие более 150 мест расщепления ДНК.

Рестриктазы бывают мелко - и крупнорасщепляющими. Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы больше разрывов, чем вторые, узнающие последовательность из 6 нуклеотидных пар. Следует отметить, что рестриктазы по-разному расщепляют ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие - со сдвигом с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором - «липкие», то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в 4 нуклеотида. Такие фрагменты удобны для создания рекомбинантных ДНК.

Рекомбинантные ДНК - это ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.

Сшивка фрагментов ДНК, полученных при помощи рестриктаз, производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:

- сшивка по одноименным «липким» концам - любые два фрагмента ДНК, независимо от их происхождения, образовавшихся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов;

- сшивка по «тупым» концам. Это менее эффективный метод, поэтому для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются «липкими» концами;

- сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами. Для связи разноименных, то есть некомплементарных друг другу «липких» концов, используют так называемые линкеры или «переходники».

Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции (места расщепления) или их комбинацию. Существуют большие наборы линкеров, в том числе «тупой конец - липкий конец».

После того как ДНК сшита в пробирке, ее надо ввести в живые клетки и обеспечить стабильное поддержание генетической информации. Это достигается при помощи так называемых векторных молекул, или векторов.

Векторными молекулами, или векторами, называют молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию, а может быть, и экспрессию.

Экспрессия гена - проявление генетической информации, записанной в гене, в форме рибонуклеиновой кислоты, белка и фенотипического признака.

Векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнительной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, вирусы животных.

Плазмиды - кольцевые внехромосомные ДНК, способные к автономной репликации.

Бактериофаги - вирусы, инфицирующие бактерии.

Первые плазмиды - векторы, были выделены из бактерий. В последующем большинство векторов было сконструировано при помощи методов генной инженерии в соответствии с задачами экспериментаторов.